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        生物資訊

        關于慢病毒轉導的那些事

        作者:admin 來源:本站 發布時間: 2019-03-23 14:18  瀏覽次數:
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        慢病毒

         

        利用病毒傳遞系統來轉導細胞在基因和蛋白質研究已變得很常見,慢病毒載體就可以穩定地表達目的基因。

         

        慢病毒,屬于逆轉錄病毒,它的主要作用機制是表達逆轉錄酶,將病毒RNA轉化為雙鏈DNA,整合酶再將病毒DNA插入宿主DNA,然后和宿主細胞一起進行分裂。

         

        慢病毒可以感染分裂細胞和非分裂細胞,如有絲分裂后的細胞。

         

         概述

         

         

        我們都知道,病毒缺乏復制機制,所以需要細胞來“存活”。慢病毒載體傳遞系統最重要的一個方面就是慢病毒載體的生產,通常在HEK293細胞(或一些變種)。

         

        例如,慢病毒傳遞系統的一個常見用途是插入短的發夾RNAs (shRNA),用于RNAi介導的基因敲除。

         

         



        shRNA首先被包裝成慢病毒載體,然后轉染HEK293細胞。轉染的細胞孵育約3天,此間慢病毒復制和產生慢病毒顆粒,然后收獲,評價滴度,再轉化目標細胞。

         

         

         

         關于轉染HEK293細胞

        維持細胞的良好狀態是必要的。HEK293細胞生長迅速,胰蛋白酶化速度快,所以不要在胰蛋白酶中長時間孵育,否則可能會有大量細胞死亡。

         

        解凍后的細胞應至少傳代兩次,然后接種進行轉導實驗。并且要非常輕柔地處理,因為細胞很容易分離。

         

        在轉染實驗中,HEK293細胞接種于約5*10^6細胞/10cm培養皿中,接種后次日細胞約40-50%融合。

         

         為轉導做好準備

        將慢病毒載體質粒連同病毒包裝載體打包成脂質體,并將其遞送到HEK293細胞中。

         

        在實驗的包裝部分使用無血清培養基是非常重要的。無血清培養基促進DNA與陽離子脂質體復合物的形成,提高轉染效率。

         

         



        有了轉染復合物,含shRNA、包裝質粒和脂質體,就可以進行包裝了。傾斜帶有HEK293細胞的培養皿,將轉染混合物逐漸加入收集的培養基中。

         

         



        在添加轉染混合物時要謹慎,溫柔操作。一旦加入溶液,小心地旋轉平板,使培養基混合,將轉染混合物均勻地分配到細胞上。在無血清培養基中培養5-8小時。

         

        孵育后,輕輕抽吸培養基(這將包含沒有轉染HEK293細胞的含有質粒的脂質體),并在培養皿的一側加入10 ml完全培養基,這樣細胞就不會分離。HEK293細胞將shRNA包裹成病毒顆粒并釋放到培養基中。 

         

        此時,培養基中會充滿病毒顆粒,因此在搬運時應穿戴適當的防護用品。


        48小時后收集培養基(病毒顆粒),將10 ml新鮮的完全培養基加入同一培養皿中。72小時后再次收集培養基,與48小時收集的結合。


        通過0.45微米的過濾器對收集到的混合培養基進行消毒,以允許病毒通過。凍融循環會降低病毒的效力,所以最好進行分裝。


        病毒可以在4℃下保存一到兩個月,長期保存在-20℃。經常使用漂白劑處理在病毒產生過程中使用的吸管頭和平板。

         

         病毒進入細胞

        通常,測定病毒的效價非常重要,方便確定實驗濃度。一個良好的敲除,至少50%的細胞轉導病毒。用適當的分析方法檢查細胞是否定點敲除,通常涉及到Western Blot。


        1.使用相同比例的病毒和細胞獲得50%的轉導。在一個15ml的試管中,用5ml的完全培養基重懸約200萬個細胞(10cm培養皿的四分之一)。

         

         



        在同一試管中,加入2.5ml病毒和15ug/ml的聚凝胺。聚凝胺通過中和病毒顆粒和細胞膜之間的電荷來提高轉導效率。

         

         

         



        2.輕輕混勻,將細胞放入一個10cm的新培養皿中。24小時后,換到沒有病毒的新鮮完全培養基中。

         

         



        如果shRNA構建物含有熒光標記物,可以檢測轉染48小時后檢測是否整合成功;如果沒有,繼續進行抗生素選擇48小時。


         

          

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